细菌膜蛋白质微量提取试剂盒使用方法

使用方法

准备：第一次使用本试剂盒时需要将所有 DNase I 干粉倒入溶液 B 中，轻柔颠倒 使 DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一个月内完，否则 DNase 将逐渐失去活性。此外，最好在实验前 1 小时将溶液 B 冰浴预冷。 

用法一：小量制备（主要用于上样量比较小的 SDS-PAGE 电泳等实验）

1、 收集 20-40 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。

2、 加入 2 mL 溶液 A，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液 A 中。

3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。 4、 加入 0.5 mL 溶液 B（必须已经提前加入了 DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌 重悬。注：如果细菌起始量没有 20-40 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。 重悬在溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。 

5、 用超声或 French Press 方法裂解细胞。如果用 French Press 方法，则需要 处理至少两次，每次的压力为 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不论用哪 种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌 裂解过程，直到 80%以上的细菌都裂解为止。

6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料离心管中 （如 Beckman Optima 台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。

7、 在上清（细菌裂解液）中加入 5 mL 预冷的溶液 C，轻柔颠倒混匀后冰浴放置 30-60 分钟。其间可以轻柔颠倒混匀 3-5 次。

8、 用 Bechman Optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以 使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。

9、 小心移弃上清，在沉淀中加入 0.2 mL 溶液 A，充分吹打混匀。

10、用 Beckman Optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可 以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。 11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自备的， 跟后续实验兼容的缓冲液（如 1×SDS-PAGE 上样液中，可从本公司购买）， 所得膜蛋白的浓度将在 1mg/mL 左右。

用法二：大量制备（主要用于上样量比较大的 2D 电泳等实验） 

1、 收集 200-400 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。

2、 加入 20 mL 溶液 A，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液 A 中。

3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。

4、 加入 5 mL 溶液 B（必须已经提前加入了 DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有 200-400 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。

5、 用超声或 French Press 方法裂解细胞。如果用 French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程，直到 80%以上的细菌都裂解为止。

6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中，弃沉淀（未破裂细胞）。

7、 在上清（细菌裂解液）中加入 50 mL 预冷的溶液 C，轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60 分钟。注：可以在大烧杯中装冰，然后将装有样品的小烧杯放入，在放入干净的搅拌子，以zui低速度搅拌。

8、 用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。

9、 小心移弃上清，在沉淀中加入 2 mL 溶液 A，充分吹打混匀。

10、用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。

11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在 1 mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液（如 1×等电点电泳上样液，可从本公司购买），所得膜蛋白的浓度在 1mg/mL 左右。