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线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)样本的前处理

更新时间:2021-08-26      点击次数:940

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器

或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g,4℃离心 5min。

3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 α-KGDH(此步可选做)。

5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或

200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 α-KGDH 活性测定。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)在试剂五中加入 18mL 试剂四充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)

水浴 10min;现配现用;

(2)在试剂六中加入 1mL 蒸馏水,充分溶解待用;现配现用;

(3)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂六和 180μL 试剂五,混

匀,立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

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