人视网膜母细胞瘤抑制蛋白(pRB)免疫组化试剂盒实验步骤

实验步骤：

1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr；石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度

2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；

3.水化： 切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2 次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min；

4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，直接进入第5 步封闭。

5.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育30 min；

6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗），37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜；

7.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；

8.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育10 min；

9.加二抗： 滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育30 min；

10.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；

11.封闭： 滴加试剂Tween 20，37℃湿盒孵育封闭20 min；

12.加HRP-SA： 滴加用抗体稀释液稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20 nM），

37℃湿盒中孵育30 min；

13.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min），TBS 洗涤（2×5 min）；

14.显色：应用DAB 溶液（试剂F）显色；

15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；

16.封片： 待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；

17.观察成像： 显微镜下观察成像。

磷酸化有丝分裂激酶B/C抗体

磷酸化腺泡Acinus蛋白抗体

磷酸化肾上腺素能受体β2抗体

APS抗体

激活素受体样激酶1抗体

激活素A受体1B抗体

磷酸化雄激素受体抗体

磷酸化A-Raf抗体

酰基鞘氨醇脱酰酶2抗体

脂肪细胞特异性粘附分子抗体

腺相关病毒5抗体

腺苷酸活化蛋白激酶γ3抗体

腺苷单磷酸活化蛋白激酶β2抗体

磷酸化细胞周期末期促进复合蛋白APC1抗体

细胞周期末期促进复合蛋白APC1抗体

磷酸化蛋白激酶B2抗体

磷酸化铁蛋白Fe65抗体

磷酸化铁蛋白Fe65抗体

磷酸化APP淀粉样肽前体蛋白抗体

磷酸化APP淀粉样肽前体蛋白抗体

磷酸化活化复制因子2抗体

磷酸化活化复制因子2抗体

磷酸化细胞周期末期促进复合蛋白APC1抗体