无色杆菌属通用PCR检测试剂盒说明书

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

原理是由一对引物介导，能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增，经过n个热循环扩增，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0＜E＜1,扩增效率＝倍，使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。
 特异性强
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
​
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

5%葡萄糖肉汤培养基/5% Dextrose Broth Medium药品细菌培养，滴眼剂金黄色葡萄球菌培养等250克国产/进口

大鼠肠静脉内皮细胞*培养基100mL

A9(小鼠下结缔组织细胞)5×106cells/瓶×2

亮白曲霉 Aspergillus candidus小鼠成骨细胞*培养基

PANC-1, 人胰腺细胞豇豆慢生瘤菌 Bradyrhizobium vigna

糖胆发酵管培养基/Lactose Bile Broth用于大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的测定250克国产/进口

沙氏BHI琼脂/沙氏脑心浸琼脂/Sabouraud BHI Agar真菌检测250克国产/进口

Lane Marker Loading Buffer(5x)/蛋白示踪上样缓冲(还原,5x)5ml5ml

CCL-149(大鼠肺泡上皮细胞)小鼠骨髓间充质干细胞（EGFP标记）

SOC肉汤/SOC BrothBR250克国产/进口

酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeU-937(人组织细胞淋巴瘤细胞)

无色杆菌属通用PCR检测试剂盒说明书酸球菌亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis核侧耳 Pleurotus tuber-regium

冬拟多孔菌吴茱萸碱

枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilishDPSCs, 人前磨牙牙髓干细胞

HBL-100(人整合SV40基因的腺上皮细胞)烟曲霉 Aspergillus fumigatus

酸球菌霍氏亚种 Lactococcus lactis subsp. hordniae大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum

苜蓿中华根瘤菌 Sinorhizobium melilotiLLC(小鼠肺细胞)

Saos-2，人成骨瘤细胞泡盛曲霉 Aspergillus awamori

戊糖杆菌 Lactobacillus pentosus嗜热脂肪芽胞杆菌 Bacillus thermophilus

毛柄金钱菌(金针菇) Flammulina velutipesHCG803/胃细胞

苏云金芽胞杆菌苏云金变种 Bacillus thuringeinsis subsp. thuringeinsis酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

中性蛋白酶(含100mL酶解缓冲液)黑曲霉 Aspergillus niger

泡盛曲霉 Aspergillus awamori大鼠卵巢上皮细胞*培养基

百脉根根瘤菌 Rhizobium loti酸球菌脂亚种 Lactococcus lactis subsp. cremoris

Molt-4/急性淋巴母细胞白血病细胞阿舒假囊酵母 Crebrothecium ashbyii

炭黑曲霉 Aspergillus carbonarius小鼠肝星形细胞*培养基

雪白小四孢菌 Microtetraspora niveoalba寡养单胞菌 Stenotrophomonas sp.

技术原理：
 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
       在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。（ DNA高温变性低温复性）
       发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。