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海藻糖酶(TREH)真核蛋白操作步骤

更新时间:2023-07-12      点击次数:363

操作步骤:


Ⅰ 实体组织蛋白的提取


1. 在每1mL 冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制剂, 1 μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF,混匀。冰上保存数分钟待用。


2.  每100mg固体组织置于培养皿中,剪碎成3mm×3mm左右的小块,加入0.5~1 mL冷 Lysis Buffer,玻璃匀浆器上下手动匀浆15次,注意低温操作;


3. 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管,离心10000转/分,4℃离心5 min;


4. 取上清转移至新的预冷的离心管中,即为全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford法、BCA法);


5. 分装保存于-70℃,避免反复冻融。


Ⅱ 培养细胞蛋白提取


1. 贴壁培养的细胞,吸去培养基后,加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次,每次振摇数次以尽量去除培养液;


2. 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞,将细胞及培养液移至离心管中, 1000转/分离心10 min,再用10mL/150mm培养板的冷PBS,1000转/分离心5 min洗两次;


3. 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入10μL磷酸酶抑制剂, 1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF,混匀。冰上保存数分钟待用。


4. 细胞洗涤后,转至新的预冷的离心管中,加入上述配制好的冷Lysis Buffer,加入量如下表所示:


细胞数量


Lysis Buffer加入量


02个


0.5 mL~1 mL


5×4583个


0.2 mL~0.5 mL


5.置于4℃摇床平台上,温和振荡15 min;


6. 14,000rpm,4℃离心15min,取上清为全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford法、BCA法);


7. 分装保存于-70℃,避免反复冻融


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